KIP-Veröffentlichungen

Untersuchungen zur Her2/neu-Amplifikation und -Expression, die im Zusammenhang mit der Entstehung von Brustkrebs und seiner Diagnostik stehen, sind für eine zusätzliche Verfeinerung der Diagnoseparameter und damit einer Verbesserung der Therapieansätze von enormer Bedeutung. In dieser Arbeit wurden durch hochauflösende lichtmikroskopische Verfahren grundlegende Untersuchungen zu Her2/neu sowohl auf Gen-, als auch auf Proteinebene durchgeführt, um neue und unterstützende Ansätze für einen besseren Therapieerfolg bei Brustkrebspatienten zu erhalten. Eine genaue Auszählung der Her2/neu-Genkopien mit herkömmlichen Markierungsmethoden (z.B. Fluoreszenz in situ Hybridisierung) ist momentan durch die Sondengrößen und die konventionelle mikroskopische Auflösung nur unzureichend möglich. Die molekularbiologische Methode der kombinatorischen Oligonukleotid-Fluoreszenz in situ Hybridisierung in Verbindung mit sensitiver hochauflösender Lichtmikroskopie bietet aufgrund der kleinen Sonden und der verbesserten Auflösung einen neuen Ansatzpunkt der eine eindeutigere Zuordnung der einzelnen Her2/neu-Genkopien ermöglicht und somit eine genauere Auszählung der Fluoreszenzsignale zulässt. Erstmals werden für diese Untersuchungen Peptid-Nukleinsäure (PNA)-Oligosonden eingesetzt, da diese große Vorteile in der Lebendzellmarkierung zeigen (z.B. Nukleasen-, Peptidasen- und Proteasenresistenz, höhere chemische Stabilität als DNA / RNA, Anlagerung an den nativen DNA-Strang, etc.). Die Modifikation dieser kleinen Fluoreszenzsonden mit Twisted Intercalating Nucleic Acids (TINA) verbessern die Anlagerung der PNAs an den nativen DNA-Strang. Diese schonende Hybridisierung ermöglicht Abläufe innerhalb der Genomorganisation ohne destruktive Strukturveränderung zu beobachten. Das in der Arbeit etablierte und optimierte COMBO-FISH-Protokoll für fluoreszenzmarkierte PNA-Oligosequenzen führte zu erfolgreichen Hybridisierungen mit repetitiven Zentromer- und genspezifischen Sonden. Die TINA-modifizierten-PNA-Sonden zeigten bei der Lebendzellmarkierung ebenfalls gute Hybridisierungs-Effizienzen. Weiterhin konnte man an Brustkrebszellen mit unauffälligem Genotyp die Spezifität des Her2/neu-Sondensets bestätigen. Abschließend konnte gezeigt werden, dass durch die Kombination hochauflösender Lokalisationsmikroskopie mit COMBO-FISH-Sonden eine effektive optische Auflösung in biologischen Präparaten bis zu einigen wenigen Nanometern erreicht werden kann, um Untersuchung von struktur-abhängigen Genomfunktionen oder Fehlfunktionen durchführen zu können. Die Etablierung der Lokalisationsmikroskopie führte zu vielen biologischen Grundlagenexperimenten. Es wurden Präparate mit fluoreszenten Proteinen, organischen Farbstoffen und Alexa konjugierten Antikörpern untersucht. Diese Untersuchungen führten zu einer optimalen Auswahl an Farbstoffmolekülen für weiterführende Experimente. Zusätzlich wurden unterschiedliche Markierungsmethoden verwendet und Experimente mit unterschiedlichen Einbettmedien realisiert, die Aufschluss über das Blinkverhalten der Fluoreszenzfarbstoffe in der jeweiligen Umgebung gaben. Die durchgeführten Untersuchungen der Her2/neu-Rezeptorcluster und ihrer Nanostruktur auf der Zelloberfläche mittels Lokalisationsmikroskopie ermöglichen eine neue Korrelation zwischen Genkopienzahl, Überexpression und molekularer Rezeptorstrukturen. Anhand von Her2/neu Cluster-Analysen konnten klare Expressionsmuster für unterschiedliche Brustkrebszelllinien erarbeitet werden. Diese Expressionsanalysen lassen eine klare Diskriminierung zwischen gesunden und kranken Zellen sowie zwischen Brustkrebszelllinien untereinander zu. Diese verfeinerten Erkenntnisse könnten zu einer verbesserten Diagnostik beitragen, die es beispielsweise erlaubt, eine verbesserte Prognose zum Therapieerfolg zu geben. Weiterhin wurde Her2/neu-Her3-Heterodimere untersucht, die über Neuregulin-1 als Ligand induziert wurden. Die Dimerisierungen setzen mehrere wichtige Signaltransduktionswege des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung in Gang. Die dadurch resultierende Deregulation der Zelle kann folglich zu einer starken Zellproliferation führen und somit zur Tumorgenese beitragen. Ein Versuchsansatz mit einer Vielzahl von Antikörpern gegen denselben Rezeptor könnte die Fluoreszenzsausbeute bei den Lokalisationsmessungen um ein vielfaches verbessern und kann zukünftig genutzt werden, um noch feinere Expressionsmusteranalysen durchführen zu können.

Studies of Her2/neu amplification which are associated with the development of breast cancer and its diagnosis are of great importance for a further refinement of the diagnostic parameters and can thereby improve therapeutic approaches. In this work fundamental studies based on high-resolution light microscopy both on gene as well as on protein level of Her2/neu were performed, to obtain new and supportive approaches for an improved therapeutic success in breast cancer patients. Due to the probe size and the microscopic resolution an accurate count of the Her2/neu gene copies using conventional labelling methods (FISH = fluorescence in situ hybridization) is not sufficiently feasible. COMBO-FISH (combinatorial oligonucleotide FISH) in combination with sensitive high-resolution light microscopy, allows a clear identification of each Her2/neu gene copy and thus a more accurate count of the fluorescence signals. This is due to the small probe size and the improved resolution. In this investigations peptide nucleic acids (PNA) were used as they have great advantages in labeling of live cells (e.g. nuclease- and protease resistance, higher chemical stability than DNA / RNA, binding to the native DNA strand). The modification of these small fluorescent probes with Twisted Intercalating Nucleic Acids (TINA) further improves the binding of PNAs to the native DNA strand. This gentle hybridisation allows to observe processes within the genome organisation without introducing destructive structural changes. The in this work established and optimised COMBO-FISH protocol for fluorescence labeled PNA oligo sequences led to successful hybridisations with repetititve centromere and gene specific probes. The TINA modified PNA probes showed also improved hybridisation and labeling efficiencies in live cell experiments. Furthermore, the specifity of the new synthesised Her2/neu probeset was confirmed. This was done by using breast cancer cells with an normal genotype. Finally, it was shown that the combination of high-resolution localisation microscopy with COMBO-FISH probes allowed an optical resolution in biological specimen down to a few nanometers. This result facilitates investigations of structure dependent genome functions or dysfunction. The new development of the localisation microscopy led to various fundamental biological experiments. Therefore specimen with fluorescent proteins, organic dyes and Alexa conjugated antibodies were examined. This first verifications allowed choosing the optimal dye molecules for further experiments. In addition, different labeling methods were used and experiments with different embedding medias were realised, revealing the blinking behaviour of the fluorescent dyes within the respective environments. The further investigations of Her2/neu receptor cluster and their nanostructure on the cell surface using localisation microscopy facilitates a new correlation between gene copy number, overexpression and molecular receptor structures. Based on this Her2/neu cluster analysis, a distinctive characterisation of the expression patterns of different breast cancer cell lines was gained. These expression studies permit a clear discrimination between healthy and diseased cells as well as between different breast cancer cell lines. This refined results could improve diagnosis and may lead to a better prognosis for therapeutic success. Furthermore ligand (neuregulin-1) induced Her2/neu-Her3 heterodimeres were examined. The dimerisations activate several important transduction pathways of cell growth and cell differentation. This deregulation of the cells and the resulting strong cell proliferation can lead to tumorigenesis. Using a variety of antibodies against the same receptor could enhance the fluorescence yield in the localisation measurements. This enhancement can be used in future to analyse the protein expression patterns even preciser.