KIP-Veröffentlichungen

Eine Trinukleotid-Expansion auf dem Gen FMR1 ist die Ursache für die Inaktivierung dieses Gens bei Menschen, die am Fragilen X-Syndrom leiden. Man vermutet die Ausbildung von Heterochromatin in diesem Bereich. In dieser Arbeit wurde die Expansionsregion von menschlichen Fibroblasten, die dieses Syndrom tragen, spezifisch mit kombinatorischer Oligonukleotid-Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (COMBO-FISH) markiert. Die markierte Zell-DNS wurde mit Epifluoreszenz-, Konfokal- und Lokalisationsmikroskopie untersucht. Erstmals konnten fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von der Position dieser Expansionsregion innerhalb des Zellkerns und relativ zu den mit FISH markierten X-Chromosomenterritorien gemacht werden. Ebenfalls zum ersten Mal konnten Aufnahmen der Nanostruktur des markierten Expansionslocus mithilfe der Lokalisationsmikroskopie durchgeführt und quantitativ ausgewertet werden. Für die Markierung wurden DNS- und PNS-Sonden verwendet. Es wurden Kolokalisationsexperimente durchgeführt um die Spezifität zu validieren. Des Weiteren wurden unter Anwendung bioinformatischer Methoden tripelhelikal und doppelhelikal bindende Sondensets für die Markierung und Strukturanalyse der an die Expansionsregion angrenzenden Genabschnitte entworfen. Ein durchgeführtes Sequenzalignment der FMR1-Gensequenzen fünf verschiedener Spezies lieferte nicht transkribierte evolutionär konservierte Abschnitte, die womöglich Anteil an der Regulierung der physiologische Faltung des gesunden Gens haben. Schließlich wurden erste Schritte für die Bestimmung der Durchführbarkeit einer neuen Methode die Aktivität eines Gens mit COMBO-FISH zu bestimmen in silico ausgeführt.

A trinucleotid repeat expansion in the gene FMR1 is the cause of inactivation of this gene in humans who suffer from the Fragile X syndrome. One supposes the formation of heterochromatin in this area. In this work the region of expansion of human fibroblasts that carry that syndrom was marked specifically with COMBO-FISH. The marked cell DNA was examined by epifluorescence, confocal and localisation microscopy. For the first time fluorescence microscopic images of the position of this region of expansion within the nucleus and relatively to the X-chromosome territories, which were marked with FISH, were taken. Also for the first time imaging of the nano structure of the marked locus of expansion was carried out by localisation microscopy and was quantitatively evaluated. The mark was performed by using DNA and PNA probes. Experiments of colocalisation were carried out to validate specificity. In addition triple helical and double helical binding probe sets were designed for marking the genetic segments adjacent to the expansion region and analysing its structure. A sequence alignment of the FMR1 gene in five different species provided non-transcribed evolutionary preserved segments, that possibly take part in regulation of gene folding. Finally, first steps were made in silico for determining the feasibility of a new method of deducing a gene’s activity with COMBO-FISH.