KIP-Veröffentlichungen

Die Kombination von Licht und Elektronenmikroskopie ist als CLEM (correlative light and electron microscopy) bekannt. Diese Technik verknüpft die hochauflösende strukturellen Informationen, generiert durch die Elektronenmikroskopie, mit den Informationen der Fluoreszensmikroskopie, die zwar eine geringere Auflösung hat, dafür die Möglichkeit bietet, spezielle Zielstruckturen zu markieren. Um biologische Proben im nativem Zustand untersuchen zu können werden diese durch schnelles Einfrieren vitrifiziert (Kryoimmobilisierung). So wird Artefaktbildung, die bei chemisch fixierten Proben auftreten kann, umgangen. In Kombination mit EM nennt man diese Technik kryoEM, die gut ethabliert ist.
Im Gegensatz zur kryoEM ist die super-auflösende Fluoreszensmikroskopie bei tiefen Temperaturen noch nicht ethabliert. Obwohl einige Fluorophore ähnliches Verhalten unter kryo-Bedingungen wie bei Raumtemperatur zeigen, stellen die hohen Laserintensitäten eine der größten Herausforderung für die sehr fragilen Proben dar.
In dieser Arbeit wird SOFI (super-resolution optical fluctuation imaging) bei kryo-Temperaturen eingeführt, um das Auflösungsvermögen zu erhöhen und das Diffraktionslimit zu überwinden. Für diese Technik sind geringere Laserintensitäten notwendig als bei anderen super-auflösenden Mikro- skopietechniken wie SMLM oder STED. Gleichzeitig ist der Versuchsaufbau deutlich weniger komplex als bei SIM. Im Ramen der vorliegenden Arbeit konnte eine Verbesserung des Auflö- sungsvermögens um den Faktor zwei gezeigt werden, was vergleichbar mit dem Auflösungsvermögen von SIM ist. Es konnte darüberhinaus auch das Potential für die Anwedung in der super-auflösenden korrelativen Kryomikroskopie.

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) is a technique that combines the high-resolution information from electron-microscopy (EM) with the specific labelling capabilities of fluorescence microscopy (FM), providing a deeper understanding of the dynamics and structures observed.
In order to analyse specimens in a near-native environment, samples are rapidly frozen to a vitreous state. This cryo-immobilization prevents the appearance of artefacts that chemical fixation would introduce. The combination of this method and EM is called cryoEM.
While cryoEM is an established technique used in structural biology, super- resolution fluorescence microscopy techniques are not yet fully developed for cryotemperatures and even though some fluorophores have been shown to work with these techniques at these temperatures, the strong laser intensities required for the super-resolution imaging present a challenge for the delicate samples.
In this thesis Super-resolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI) was implemented at cryo-temperatures in order to increase the resolution and go beyond the diffraction limit. This technique requires weaker lasers intensities than other  uperresolution techniques like SMLM and STED, and a less complicated setup than SIM.
A resolution improvement factor of up to two and prove its capabilities for its use in super-resolution cryo-CLEM was demonstrated.