KIP-Veröffentlichungen

Einige neuere Studien haben Beweise vorgestellt, dass eine Mutation des für die Produktion des E3-Ubiquitin-Protein-Ligase Smurf2 verantwortlichen Gens eine Schwächung der Chromatinstruktur-Stabilität sowie der Reparaturmechanismen der DNA-Schädigung induziert. Somit wird die Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Arten von Krebs deutlich erhöht. In dieser Bachelorarbeit haben wir erste Schritte in Richtung der Darstellung, und somit der besseren Verständnis-Möglichkeit des direkten Einflusses von Smurf2 auf die Chromatin-Landschaft durch die Suche nach der besten geeigneten Fluorophore-Kombination und Präparationstechnik gemacht. Zwei Probenserien mit unterschiedlichen Kennzeichnungskonfigurationen und Waschverfahren wurden analysiert, wozu Vorteile von Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie (Single Molecule Localization Microscopy) herangezogen wurden. Dieser einzigartige Ansatz bietet uns die Möglichkeit, Positionen der einzelnen Moleküle zu überwachen und dabei die Standorte einzelner Proteine zu analysieren. Während der Auswertung der Versuchsreihe haben wir mehrere Vorschläge zur Verbesserung des Färbungsprotokolls eingebracht. Optimierung des Kennzeichnungssystems wurde zur Vermeidung von Überlagerungen zwischen Fluoreszenzmarkern empfohlen. Aufgrund der übermäßigen Anzahl der Markierungsmoleküle außerhalb der  Region von Interesse. Änderungen der Waschprozedur wurden vorgeschlagen. Zwei neue Waschverfahren wurden  untersucht und das bessere wurde gewählt. Nach der Anwendung unserer Vorschläge sind in einem der Kanäle ungewöhnlich hohe Hintergrundintensitäten aufgetreten, die verschiedene Ursachen haben können. Darüber hinaus wurden weitere Verbesserungen des Kennzeichnungssystems vorgeschlagen. All dies machte quantitative Untersuchungen schwierig, teilweise unmöglich. Erste Versuche, statistische Muster aufzudecken, indem die Anzahl der detektierten
Signale analysiert wurde, lassen keine Schlüsse zu ziehen, aber einige Trends konnten schon aufgedeckt werden. Dennoch haben wir gezeigt, dass SMLM zusammen mit SIM für diese Art von Projekt geeignet sind. Der nächste Schritt wird spezielle, für die Zwecke der Cluster-Analyse entworfene Software erfordern, die eine Frage der weiteren Studien wäre.

Some recent studies presented evidences, that a mutation of the gene responsible for production of the E3 ubiquitin-protein ligase Smurf2 induces the weakening of the DNA damage response mechanism and of the chromatin structure stability with further increase of sensitivity to different types of cancer. In this bachelor thesis, we have made the first steps towards illustrating of the Smurf2 direct influence on the chromatin landscape by looking for the best suitable fluorophore combination and preparation technique. Two sample series with different label configurations and washing procedures were analyzed using advantages of Single Molecule Localization Microscopy technique. This unique approach grants us possibility to monitor the positions of single molecules, which allows us to analyze the locations of separate proteins. During the evaluation of the test series, we have made several suggestions for improvement of the staining protocol. Optimization of the labeling scheme was recommended in order to avoid interference between fluorescent markers. Due to the excessive number of the label molecules outside the region of interest changes to the washing procedure were suggested. Two new washing procedures were investigated and the better one was chosen. After applying our suggestions unusually high background intensities were encountered in one of the channels, which can have various reasons. In addition, further improvements of the labeling scheme have been suggested. All this made quantitative investigations difficult, partially impossible. First attempts to uncover statistical patterns by analyzing the number of detected signals do not allow to draw any firm conclusions, but some trends might be already seen. Nevertheless, we have shown, that SMLM together with SIM are suitable for this type of project. The next step will require specialized software designed for the purposes of cluster analysis, which would be a matter of the further studies.